Векторы на основе ti плазмид (6 видео) | Курс школьной геометрии

Природные векторы для растений.

Векторы на основе Ti-плазмид. Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая образование опухолей — корончатых галлов. Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плаз- мида (от ангд. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-плас миды — это естественные векторы для генов, обладающие всем* функциями, необходимыми для переноса, стабильного в ключе ния и экспрессии генетической информации в растениях. Ош_ имеют широкий круг хозяев. В бактериальных клетках Ti-плазми- ды реплицируются автономно. Эти плазмиды различаются по тигг кодируемых опинов — белков, которые используются бактериями в качестве источников азота и углерода. Обычно встречаются плазмиды, кодирующие два типа опинов: либо октопин (октопи новая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида).

Промежуточный и бинарный векторы. Эти векторы конструируются на основе Ti-плазмид. Промежуточный вектор получают путем ряда сложных операций. Сначала Т-область с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды, вставляют в вектор для клонирования в клетке Е. coli и размножают. Затем внутрь Т-области встраивают чужеродный ген и вновь размножают. Полученную реком- бинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefaciens, несущие полную Ti-плазмиду. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками Т-область рекомбинантной плазмиды, содержащая чужеродный ген, включается в Ti-плазмиду клетки хозяина, заместив в ней нормальную Т-область. Наконец, бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенными генами, заражают растения, где эти гены встраиваются в геном растительной клетки.

Бинарные векторы представляют собой бактерии, содержащие две разные Ti-плазмиды. Одна из них несет vir-область и обеспечивает интеграцию в геном растительной клетки Т-области, содержащей любые гены другой плазмиды. В этом случае двойной кроссинговер не требуется.

Однако полученные в результате заражения бактериями растительные клетки не способны к регенерации, так как у них подавлена дифференцировка. Трансформированные растительные клетки смогут дифференцироваться, если в гены, блокирующие диффе- ренцировку, ввести мутации или вырезать их из Т-ДНК.

Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Вирусы можно рассматривать как разновидности чужеродной нуклеиновой кислоты, которые реплицируются и экспрессируются в клетках растений. Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1 — 2 % чирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержа- щим. Именно эти вирусы удобны для использования в технологии Рекомбинантных ДНК, а также в качестве векторов.

ДНК-содержащие вирусы могут включать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК. В качестве представителей первой группы можно назвать вирус золотистой мозаики фасоли (ВЗМФ| или вирус полосатости кукурузы. Наиболее изученный представитель группы вирусов с двухцепечечной ДНК — вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения’ семейства крестоцветные.

Обычно фитовирусы реплицируются с образованием большое го числа копий молекул нуклеиновых кислот — 106 и более молекул на зараженную клетку. Поэтому фитовирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошей экспрессии чужеродного гена. Кроме высокой копийности вирусной нуклеиновой кислоты вирусные векторные системы имеют еще ряд преимуществ: малый размер генома (возможность легкой манипуляций вирусной ДНК) и сильные промоторы, обеспечивающие эффективную экспрессию чужеродных генов.

Однако вирусы в качестве векторов обладают и существенным^ недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и неспособ ны встраиваться в хромосомы хозяина. Небольшую емкость можно увеличить, если инфицировать вирусом (например, ВМЦК растительные протопласты, а не клетки. В этом случае инфекция не передается от клетки к клетке, нет необходимости в упаковке ДНК в вирусные частицы.

Следовательно, часть вирусного генома, ответственная за упаковку в вирусные частицы, может быть удалена и замещена до, полнительной чужеродной ДНК. Другой недостаток — отсутствий способности встраиваться в геном растительной клетки — удается обойти (по крайней мере для ВМЦК) благодаря специальном® методическому приему — агроинфекции. Для этого геном ВМЦ1 встраивают в Т-область Ti-плазмиды и в ее составе интегрируют ядерный геном различных растений.

141. Организация и «поведение» Ti- плазмиды.

Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая образование опухолей — корончатых галлов. Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плаз- мида (от ангд. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-плас миды — это естественные векторы для генов, обладающие всем* функциями, необходимыми для переноса, стабильного в ключе ния и экспрессии генетической информации в растениях. Ош_ имеют широкий круг хозяев. В бактериальных клетках Ti-плазми- ды реплицируются автономно. Эти плазмиды различаются по тигг кодируемых опинов — белков, которые используются бактериями в качестве источников азота и углерода. Обычно встречаются плазмиды, кодирующие два типа опинов: либо октопин (октопи новая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида).

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосома; клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраивает часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставляет et- таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, не обходимые для бактерий. Именно это свойство A. tumefaciens i послужило поводом для создания на основе Ti-плазмиды вектора, доставляющего необходимые гены в клетку.

Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромосомах растительных клеток, называется Т-областью в бактерии и Т-ДНК в клетках растений. Т-область включает примерно 10 % Ti-плазмиды и содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опинов и подавление дифференцировки (гормоннезависимый рост клеток). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом — в области вирулентности — vir-области (рис. 5.17).

Т-области ограничены прямыми повторяющимися последовательностями, и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений незави симо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой куль

тивируются данные клетки. В свя зи с этим очень трудно регене рировать нормальное растение и клеток, содержащих полнук, последовательность Т-ДНК. Др> гой недостаток — большие par меры

С помощью таких векторов наблюдают временную экспрессию клонир. геновTi-плазмиды, из-за коте рых затруднены какие-либо м. нипуляции с ней, поэтому вст вить ген в плазмиду традицио! ными методами невозможно.

В настоящее время констр ируются производные Ti-пла миды, в которых оставляют р гуляторный участок Т-обласг а вместо ее структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регенерации безвредны для растений.

Существуют и другие бактерии (A. rhizogenes), вызывающие усиленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri- плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ri-плаз- миды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они служат естественными безвредными векторами, так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перспективные векторы.

Дата добавления: 2015-04-16 ; просмотров: 108 ; Нарушение авторских прав

Содержание

Раздел «Генная инженерия»
Генная инженерия растений
Введение ДНК в растения с помощью Ti- и Ri-плазмид
Создание векторов на основе Ti-плазмид
📹 Видео

Видео:Вектор (молекулярная биология)Скачать

Раздел «Генная инженерия»

Видео:Введение в генную инженерию (видео 1) | Генная инженерия |Молекулярная генетикаСкачать

Генная инженерия растений

Введение ДНК в растения с помощью Ti- и Ri-плазмид

Разработаны два метода для введения Ti-плазмидных последовательностей, содержащих нужный ген, в растение.

Первый метод — метод «промежуточных векторов» (коинтегративных векторов) — основан на использовании плазмиды кишечной палочки pBR 322 (рис. 49).

Рис. 49. Создание коинтегративного вектора на основе Тi-плазмиды: Рр — расщепление рестриктазой

Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Ti-плазмиду.

Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.

Второй метод основан на создании системы бинарных (двойных) векторов.

Последние исследования показали, что для заражения и трансформации не нужна целая Ti-плазмида, а достаточны только пограничные области Т-ДНК и один участок Ti-плазмиды, ответственный за вирулентность. Причем эти два участка ДНК не обязательно должны находиться в одной и той же плазмиде. Если клетки агробактерий содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, эти бактерии могут трансформировать клетки растений. При этом Т-ДНК с любыми встроенными в нее генами интегрирует с геномом растения, для этого не нужна гомологичная рекомбинация в бактериальных клетках. Для осуществления экспрессии чужеродных генов, нужен специфический промотор из Т-ДНК, например, промотор нопалинсинтетазы.

Показано, что он функционирует в клетках растений и может быть легко соединен с кодирующей последовательностью чужеродного гена в широко распространенных субклонах Ti-плазмид. Другое преимущество данного промотора заключается в том, что он функционирует в каллусах и в большинстве органов растений. Эффективность трансформации с помощью модифицированной Т-ДНК агробактерий превосходит на сегодняшний день все другие способы переноса генов в растение.

О механизмах, с помощью которых агробактерия переносит Т-ДНК ядра растений, известно очень мало: Т-сегменты ДНК октопиновых и нопалиновых плазмид встраиваются в разные, по-видимому случайные, точки хромосом хозяина, но при этом они никогда не интегрируют с ДНК митохондрий и хлоропластов.

Для введения сконструированных Ti-плазмид в растительную клетку может быть использовано несколько методов. Наиболее простой из них природный способ — это инокуляция сконструированных штаммов в поврежденные (пораненные) области растения.

Другой метод состоит в трансформации протопластов путем кокультивирования их с агробактериями Методика кокультивации может рассматриваться как индукция опухолей в искусственных условиях: вирулентные агробактерии временно совместно культивируются с протопластами. Если агробактерии добавляются к свежевыделенным или однодневным протопластам, не наблюдается ни присоединения бактерий, ни трансформации. Существенным условием для трансформации является наличие вновь образуемых клеточных стенок у 3-дневных протопластов. Это подтверждается применением ингибиторов образования клеточной стенки, которые ингибируют и присоединение бактерий. После периода кокультивации (более суток), в течение которого наступает агрегация протопластов с бактериями, свободные бактерии удаляются повторным отмыванием. Далее растительные клетки культивируются на среде с добавлением гормонов, а через 3—4 недели небольшие колонии высеваются на безгормональную среду. На этой среде выживают только колонии трансформированных клеток.

Так были получены трансформированные растения-регенеранты табака и петунии. Этот метод дает возможность существенно расширить круг хозяев агробактерий, включая виды семейства злаковых. Эффективность кокультивирования может быть повышена применением индукторов слияния клеток (ПЭГ, кальций и др.).

Трансформация протопластов может быть проведена также кокультивированием их непосредственно с Ti-плазмидами, такие опыты были проведены с протопластами петунии, табака. Очень низкая эффективность включения Т-ДНК в протопласты, наблюдавшаяся в первых экспериментах, была затем увеличена благодаря химической стимуляции (ПЭГ). Из трансформированных клеток были получены трансгенные растения. Преимуществом этого метода является то, что отпадает необходимость в промежуточных векторах.

Видео:Свойства плазмид и их использование в генетическом клонировании. 11 класс.Скачать

Создание векторов на основе Ti-плазмид

В начале восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести чужеродные последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980], либо путем сайт-специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с Ti-плазмидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981]. Однако, эти ранние эксперименты, основанные на двойной рекомбинации, занимали много времени, были довольно сложны и трансформации проходили с очень низкой частотой. Необходимо было разработать более эффективные векторы, чтобы облегчить генетические манипуляции с бактериями и позволить селекцию и регенерацию трансформатов.

Сейчас используют две принципиально разные системы для введения чужеродных генов в растения с помощью Ti-плазмид:

В основе создания — векторов лежит тот факт, что гены тДНК не для растительных клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клетки и нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. В векторых системах тДНК можно заменить, например, на последовательность pBR322, а чужеродную ДНК, которую предполагается перенести в растения, нужно проклонировать в этом же векторе.

Затем путем гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850 [Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за синтез фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322.

ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для области тДНК pGV3850 с любыми производыми pBR, несущими клонированный ген.

Гены, кодирующие различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных растений, были встроены в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Была разработана система трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322 из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В настоящее время сконструированы и успешно используются и другие векторы на основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].

Система бинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir могут располагаться на разных плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких системах обычно присутствуют два элемента:

Ti-плазмида-помощник, в которой тДНК полностью делетирована. Эта плазмида несет в своем составе гены vir, действующие in trans.

Плазмида широкого круга хозяев, имеющая сайты для клонирования и маркерные гены для селекции растений, ограниченные правой и левой фланкирующими последовательностями тДНК [An et al., 1988].

Обе описанные выше системы векторов предполагают этапах сборку нужных конструкций в промежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena, Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в готовом виде в рецепиентные штаммы агробактерий.