Видео:Свойства плазмид и их использование в генетическом клонировании. 11 класс.Скачать
Генная инженерия растений
Введение ДНК в растения с помощью Ti- и Ri-плазмид
Разработаны два метода для введения Ti-плазмидных последовательностей, содержащих нужный ген, в растение.
Первый метод — метод «промежуточных векторов» (коинтегративных векторов) — основан на использовании плазмиды кишечной палочки pBR 322 (рис. 49).
Рис. 49. Создание коинтегративного вектора на основе Тi-плазмиды: Рр — расщепление рестриктазой
Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Ti-плазмиду.
Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.
Второй метод основан на создании системы бинарных (двойных) векторов.
Последние исследования показали, что для заражения и трансформации не нужна целая Ti-плазмида, а достаточны только пограничные области Т-ДНК и один участок Ti-плазмиды, ответственный за вирулентность. Причем эти два участка ДНК не обязательно должны находиться в одной и той же плазмиде. Если клетки агробактерий содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, эти бактерии могут трансформировать клетки растений. При этом Т-ДНК с любыми встроенными в нее генами интегрирует с геномом растения, для этого не нужна гомологичная рекомбинация в бактериальных клетках. Для осуществления экспрессии чужеродных генов, нужен специфический промотор из Т-ДНК, например, промотор нопалинсинтетазы.
Показано, что он функционирует в клетках растений и может быть легко соединен с кодирующей последовательностью чужеродного гена в широко распространенных субклонах Ti-плазмид. Другое преимущество данного промотора заключается в том, что он функционирует в каллусах и в большинстве органов растений. Эффективность трансформации с помощью модифицированной Т-ДНК агробактерий превосходит на сегодняшний день все другие способы переноса генов в растение.
О механизмах, с помощью которых агробактерия переносит Т-ДНК ядра растений, известно очень мало: Т-сегменты ДНК октопиновых и нопалиновых плазмид встраиваются в разные, по-видимому случайные, точки хромосом хозяина, но при этом они никогда не интегрируют с ДНК митохондрий и хлоропластов.
Для введения сконструированных Ti-плазмид в растительную клетку может быть использовано несколько методов. Наиболее простой из них природный способ — это инокуляция сконструированных штаммов в поврежденные (пораненные) области растения.
Другой метод состоит в трансформации протопластов путем кокультивирования их с агробактериями Методика кокультивации может рассматриваться как индукция опухолей в искусственных условиях: вирулентные агробактерии временно совместно культивируются с протопластами. Если агробактерии добавляются к свежевыделенным или однодневным протопластам, не наблюдается ни присоединения бактерий, ни трансформации. Существенным условием для трансформации является наличие вновь образуемых клеточных стенок у 3-дневных протопластов. Это подтверждается применением ингибиторов образования клеточной стенки, которые ингибируют и присоединение бактерий. После периода кокультивации (более суток), в течение которого наступает агрегация протопластов с бактериями, свободные бактерии удаляются повторным отмыванием. Далее растительные клетки культивируются на среде с добавлением гормонов, а через 3—4 недели небольшие колонии высеваются на безгормональную среду. На этой среде выживают только колонии трансформированных клеток.
Так были получены трансформированные растения-регенеранты табака и петунии. Этот метод дает возможность существенно расширить круг хозяев агробактерий, включая виды семейства злаковых. Эффективность кокультивирования может быть повышена применением индукторов слияния клеток (ПЭГ, кальций и др.).
Трансформация протопластов может быть проведена также кокультивированием их непосредственно с Ti-плазмидами, такие опыты были проведены с протопластами петунии, табака. Очень низкая эффективность включения Т-ДНК в протопласты, наблюдавшаяся в первых экспериментах, была затем увеличена благодаря химической стимуляции (ПЭГ). Из трансформированных клеток были получены трансгенные растения. Преимуществом этого метода является то, что отпадает необходимость в промежуточных векторах.
Видео:Введение в генную инженерию (видео 1) | Генная инженерия |Молекулярная генетикаСкачать
Генетическая инженерия растений
Видео:Плазмиды: общая информация и классификацияСкачать
Трансформация растительного генома
Важным преимуществом растений, по сравнению с животными, является способность их клеток развиваться в целое растение (т. е. тотипотентность), что широко используется в работах по получению трансгенных растений.
Генетическая трансформация растений с помощью методов генетической инженерии может быть осуществлена векторным способом (с использованием агробактерий и вирусов) и путем прямого переноса генов.
Наиболее изученным примером работы плазмидных векторов служит введение чужеродных генов в геном растений с помощью Ti- и Ri-плазмид почвенных бактерий рода Agrobacterium. С помощью этих плазмид бактерии могут интегрировать свой генетический материал в клетки двудольных растений.
Ti-плазмида (от англ, tumor inducing — индуцирующая опухоль) обнаружена в клетках некоторых штаммов Agrobacterium tumefaciens. Выделенная в чистой культуре, эта бактерия может приводить к образованию опухолей у двудольных растений, что, по существу, может рассматриваться как природная генно-инженерная система.
Ri-плазмида (от англ, root inducing — индуцирующая корни) присутствует в штаммах Agrobacterium rhizogenes.
В 1970-х гг. Дж. Шелл с сотрудниками выявил, что причиной опухолеобразования являются Ti-плазмиды, обнаруженные в клетках некоторых штаммов A. tumefaciens. Ti-плазмида проникает из клетки бактерии в растение, и часть ее, называемая Т-ДНК (от англ, transferred DNA — переносимая), ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемого растения (рис. 4.10). В природе этот фрагмент переносит гены, которые способствуют размножению агробактерий и дают им возможность паразитировать на пораженном растении.
Гены, входящие в состав Т-ДНК, функционируют лишь после их переноса в растительную клетку. Будучи интегрированной с хромосомой, Т-ДНК индуцирует в месте заражения образование опухоли (корончатых галлов, напоминающих раковые клетки животных), гиперпродукцию фитогормонов — цитокининов и ауксина, а также синтез ряда производных аминокислот, опинов — веществ, которых нет в здоровых клетках ни у одного растения.
Опухоль возникает вследствие нарушения баланса фитогормонов, т. е. как результат функционирования онкогенов, продуктами которых являются ауксины и цитокинины. Опины, выделяемые клетками опухоли, бактерия использует в качестве источников углерода и азота для своего роста и размножения. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует клетку со встроенной Т-ДНК как «фабрику», продуцирующую опины. Такие отношения A. tumefaciens и растения Дж. Шелл назвал генетической колонизацией, которая представляет собой эксперимент по генетической инженерии, поставленный самой природой.
Рис. 4.10. Генетическая колонизация растения A tumefaciens (по Э.С. Пирузян, 1989):
1 — агробактерии существуют в ризосфере; 2 — строение A. tumefaciens; 3 — встраивание Т-ДНК в геном; 4 — образование опухоли
Строение Ti-плазмид хорошо изучено. Они включают в себя:
- — Т-ДНК — область ДНК, где содержатся гены, ответственные в итоге за морфологию опухоли и синтез фитогормонов, вызывающих неконтролируемый рост опухолевых клеток, а также гены, ответственные за синтез опинов — источников углерода и азота для питания бактерий. Именно все эти гены передаются в ядерный геном растительной клетки;
- — у/г-область — содержит гены, ответственные за вырезание, перенос и интеграцию Т-ДНК в хромосомы растений. Индукция этих генов обратима, что очень важно для бактериальных клеток. Если зараженное растение уже больно и является нежизнеспособным организмом, то переноса Т-ДНК не происходит;
- — ori-область — содержит гены, продукты которых обеспечивают репликацию Ti-плазмиды;
- — fra-область — содержит гены, ответственные за конъюгацию бактерий.
Ti-плазмида оказалась идеальным природным вектором для введения чужеродных генов в клетки растения. Проще всего было бы заменить Т-ДНК на чужеродные (полезные) гены, ввести их в плазмиды агробактерий и заразить ими растения, так как гены, ответственные за индукцию опухоли, синтез опинов и подавление дифференциации клеток поражаемого растения, расположены близко друг от друга в Т-ДНК. В то же время гены, ответственные за перенос и интеграцию Т-ДНК в хромосомы растений, находятся в другой области Ti-плазмиды — в uir-области.
Итак, на основе Ti-плазмиды в условиях эксперимента создают искусственные векторы. Для создания трансгенных растений гены, кодирующие хозяйственно ценные признаки, встраивают в Т-ДНК. Эту же область снабжают маркерными генами (для отбора трансформированных растительных клеток), эукариотическим промотором (например, 358-промотор вируса мозаики цветной капусты — CAMV) и уникальными сайтами рестрикции.
Однако размеры Ti-плазмид слишком велики и не позволяют использовать их в качестве вектора. Для решения этой проблемы была создана специальная технология — бинарная система.
Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды и встраивают, например, в плазмиду pBR322, способную к саморепликации в клетках Е. coli. Таким образом осуществляют клонирование Т-ДНК (многократное увеличение числа копий) в составе pBR322. Векторную систему (Т-ДНК — pBR322) выделяют из клеток Е. coli и встраивают в Т-ДНК интересующие гены. Новую векторную систему снова размножают в клетках Е. coli, а затем вводят в клетки Agrobacterium tumefaciens, в которых находятся нормальные Ti-плазмиды. В результате гомологичной рекомбинации векторная система и Ti-плаз- мида обмениваются участками Т-ДНК. Теперь клетки Agrobacterium tumefaciens несут в составе своих плазмид чужеродные гены, которые они могут передать в ядерный геном растительных клеток, что и приводит к созданию трансгенных растений.
Видео:Клонирование ДНК и рекомбинантная ДНК (видео 4) | Генная инженерия | Молекулярная генетикаСкачать
Природные векторы для растений.
Читайте также:
|
![Construction of a Plasmid Vector [HD Animation]](https://i.ytimg.com/vi/KRpik9mNRm0/0.jpg)
