| D-0196 | РеалБест ВИЧ ПЦР (комплект 2)
Набор реагентов для выявления РНК вируса иммунодефицита человека методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Не содержит реагентов для выделения РНК.
- Разработка и клиническая апробация тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ на основе метода Real-Time ПЦР
- Однопробирочный тест для выявления и количественного анализа РНК генетических разновидностей ВИЧ, включая редкие не-М группы ВИЧ-1 и ВИЧ-2, на основе ОТ-ПЦР в реальном времени Текст научной статьи по специальности « Фундаментальная медицина»
- Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Прасолова Мария Анатольевна, Иванов Михаил Константинович, Гашникова Наталья Матвеевна, Нетёсова Екатерина Сергеевна, Дымшиц Григорий Моисеевич
- Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Прасолова Мария Анатольевна, Иванов Михаил Константинович, Гашникова Наталья Матвеевна, Нетёсова Екатерина Сергеевна, Дымшиц Григорий Моисеевич
- A Single-Tube Real-Time RT-PCR Assay for the RNA Detection and Quantification of Genetically Diverse HIV Including Rare Non-M Group of the HIV-1 and HIV-2
- Текст научной работы на тему «Однопробирочный тест для выявления и количественного анализа РНК генетических разновидностей ВИЧ, включая редкие не-М группы ВИЧ-1 и ВИЧ-2, на основе ОТ-ПЦР в реальном времени»
- 🎦 Видео
Видео:Современная диагностика ВИЧ-инфекцииСкачать
Разработка и клиническая апробация тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ на основе метода Real-Time ПЦР
Принцип детекции накопления флуоресцентного сигнала в процессе ПЦР-амплификации (Real-Time ПЦР) открыл широкие возможности перед молекулярной диагностикой. Наибольшая ценность данного метода заключается в возможности количественных измерений. Причем, в отличие от традиционных подходов (например, ПЦР с гибридизационно-ферментной детекцией) метод Real-Time ПЦР позволяет проводить количественные измерения в более широком линейном диапазоне за меньшее количество времени.
С этим связано появление в последнее время большого количества новых тест-систем, в основе которых лежит метод Real-Time ПЦР (или ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени). В частности, для диагностики ВИЧ-инфекции за последний год появилось на Российском рынке сразу 3 коммерческие тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ. Одна из них была разработана на базе ЦНИИЭ – «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT». При создании тест-системы за основу была взята ранее разработанная и широко апробированная тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор» с детекцией продуктов амплификации методом гибридизационно-ферментного анализа. В основе этих двух тестов лежит принцип ПЦР-амплификации ВИЧ совместно с внутренним контрольным образцом (ВКО). Причем, ВКО играет роль не только контроля качества проведенного анализа в каждом образце, но и является количественным стандартом, относительно которого рассчитывается концентрация РНК ВИЧ в образце. Это имеет большое значение при работе с клиническим материалом, для которого возможна различная эффективность экстракции нуклеиновых кислот.
Целью настоящей работы было проведение расширенных клинических испытаний тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» в сравнении с двумя традиционными ПЦР-тестами «АмплиСенс ВИЧ Монитор» и «CobasAmplicor HIV-1 Monitor v. 1.5».
Материалы и методы.
Пациенты. Было протестировано 126 образцов плазмы крови от ВИЧ-инфицированных пациентов на разных стадиях заболевания из Москвы и Московской области.
Забор крови и подготовка ее к анализу. Кровь забирали у пациентов утром натощак в пробирку с 3%-ным ЭДТА из расчета 1:20. Для получения плазмы цельную кровь центрифугировали при 800-1600 g в течение 20 минут. Плазму хранили при температуре минус 70 0 С.
Определение концентрации РНК ВИЧ. Каждый образец был протестирован параллельно с помощью 3 тест-систем согласно прилагаемым инструкциям:
Тест-система «Cobas AmplicorHIV-1 Monitorv. 1.5»: анализировали 200 мкл образца, экстракцию РНК проводили вручную, ПЦР и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью автомата Cobas Amplicor. Линейный диапазон измерения: от 400 до 750000 копий/мл.
Тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор»: анализировали 100 мкл образца, экстракцию РНК проводили вручную, для амплификации кДНК использовали амплификатор GeneAmp 2400, детекцию продуктов ПЦР проводили вручную методом гибридизационно-ферментного анализа (ГИФА). Линейный диапазон измерения: от 500 до 800000 копий/мл.
Тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT»: анализировали 100 мкл образца, экстракцию РНК проводили вручную, Real-Time ПЦР проводили с помощью прибора RotorGene 3000 (CorbettResearch, Австралия). Линейный диапазон измерения: от 500 до 5000000 копий/мл.
Полученные результаты вирусной нагрузки перед анализом логарифмировали. Если разница логарифмов по одной из тест-систем превышала 0,5, образцы тестировали повторно. Дискордантными результаты считали, если разница логарифмов превышала 0,5 в двух постановках. Рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена.
Секвенирование ДНК ВИЧ. Секвенировали только те образцы, для которых были получены дискордантные результаты. По возможности секвенировали 4 фрагмента генома ВИЧ для определения генотипа: фрагмент гена p24, ген протеазы, фрагмент гена обратной транскриптазы, фрагмент гена gp120. Фрагмент гена обратной транскриптазы секвенировали с целью выяснения возможных причин получения дискордантных результатов, поскольку в области этого гена располагаются места посадки праймеров и зондов в тест-системах «АмплиСенс».
Концентрация РНК в 93 образцах (из 126) находилась внутри линейного диапазона трех анализируемых тест-систем. Отличие между результатами менее чем на 0,5 lg наблюдалось в 91% образцов. Результаты вирусной нагрузки, полученные с помощью 3 тест-систем, хорошо коррелировали между собой. Наиболее высокий коэффициент корреляции (по Спирмену) был получен между тест-системами «АмплиСенс»: 0,944.
27 образцов ниже линейного порога детекции было выявлено с помощью тест-системы «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5». Из 27 образцов было обнаружено 3 дискордантных (табл. 1).
В силу низкой концентрации РНК секвенировать дискордантные образцы не представлялось возможным. С целью выяснения причины получения более высоких значений вирусной нагрузки в тест-системах «АмплиСенс» образцы были протестированы после предварительного разведения негативной плазмой в 2 раза. Все 3 образца детектировались в 2-кратном разведении, что говорит о том, что значения, полученные в тест-системе Cobas Amplicor, скорее всего, занижены, поскольку аналитическая чувствительность тестов «АмплиСенс» составляет 300 копий/мл.
Для всех 3 тест-систем, участвовавших в данном исследовании, были получены результаты, которые хорошо коррелировали между собой. Наименьшее расхождение результатов было получено для тест-систем «АмплиСенс» (в 1 образце из 93 (1,1%) отличие между результатами составило 0,54 lg). Объясняется это тем фактом, что в обоих тестах используются одни и те же праймеры. Также высокая сходимость результатов (2 дискордантных образца из 93 – 2,2%) была получена для тест-систем «АмплиСенс ВИЧ Монитор» и «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5», что согласуется с более ранними данными по сравнительным испытаниям этих тестов [3, 4].
Наибольшее количество дискордантных результатов было обнаружено между тест-системами «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» и «Cobas AmplicorHIV-1 Monitorv. 1.5» (8 образцов из 93 – 8,6%). В 4 образцах из 8 наблюдалось завышение результатов в тест-системе «АмплиСенс» по сравнению с результатами, полученными в тест-системе «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5». При последующем тестировании этих образцов в разведениях, близких к детекционному порогу тест-систем, оказалось, что результаты вовсе не завышены. Скорее, наоборот, можно говорить о некотором занижении результатов с помощью тест-системы «Cobas Amplicor». С другой стороны, максимальное отличие между результатами не превышало 0,8 lg.
В 2 образцах из 8 дискордантных наблюдалось занижение результатов в тест-системе «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT». Кроме того, было выявлено 2 образца, в которых РНК не детектировалась с помощью тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT», в то время как в других тестах вирусная нагрузка была порядка 1000 копий/мл. Поскольку эти 4 пробы представляли для нас наибольший интерес, для них были секвенированы фрагменты гена обратной транскриптазы, в области которого располагаются места связывания праймеров и зондов, используемых в тест-системах «АмплиСенс». Для 2 проб из 4 были определены причины снижения эффективности амплификации: для пробы № 82 было обнаружено 4 мутации в месте посадки зонда, для пробы № 75 были выявлены мутации в одном из праймеров, одна из которых располагается на 3`конце. Полученные данные были использованы для дальнейшей оптимизации отечественных тестов, т.е. в ПЦР-смесь были введены дополнительные праймеры и зонды. Для двух других проб (№№ 164, 154) не было обнаружено достаточного количества мисметчей, которые бы вносили вклад в эффективность амплификации. Тем не менее, изменение соотношения праймеров в ПЦР-смеси привело к увеличению эффективности выявления этих двух образцов.
В результате проведенного исследования были показана хорошая корреляция результатов вирусной нагрузки, полученных с использованием 3 тест-систем. В подавляющем большинстве случаев отличия между результатами не превышали 0,5 lg. Проведенное исследование позволило провести оптимизацию отечественных тестов, в результате которой повысилась эффективность выявления наиболее распространенных субтипов ВИЧ-1 в России.
Видео:РеалБест экстракция 100Скачать
Однопробирочный тест для выявления и количественного анализа РНК генетических разновидностей ВИЧ, включая редкие не-М группы ВИЧ-1 и ВИЧ-2, на основе ОТ-ПЦР в реальном времени Текст научной статьи по специальности « Фундаментальная медицина»
Видео:ПЦР-диагностика заболеваний домашних животныхСкачать
Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Прасолова Мария Анатольевна, Иванов Михаил Константинович, Гашникова Наталья Матвеевна, Нетёсова Екатерина Сергеевна, Дымшиц Григорий Моисеевич
На основе метода ОТ-ПЦР с флюоресцентной детекцией в режиме реального времени разработан прототип диагностического набора, позволяющий надежно выявлять в сыворотке и плазме крови различные генетические варианты РНК ВИЧ-1 групп M,N,O,P и РНК ВИЧ-2 . Набор обладает высокой устойчивостью к нуклеотидным несоответствиям , широким линейным диапазоном измерения концентраций РНК ВИЧ, 100% аналитической специфичностью и хорошей аналитической чувствительностью: 42 МЕ/мл (ВИЧ-1 группы М), 45 копий/мл ( ВИЧ-2 ), 92 копий/ мл ( ВИЧ-1 группы O ), 90 копий/мл (ВИЧ-1 группы N). С помощью разработанного диагностического набора удалось успешно выявить и определить концентрацию РНК ВИЧ для всех образцов из международной референсной панели генотипов ВИЧ-1; результаты проведенных тестов коррелируют с данными, полученными с помощью коммерческих тестов.
Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Прасолова Мария Анатольевна, Иванов Михаил Константинович, Гашникова Наталья Матвеевна, Нетёсова Екатерина Сергеевна, Дымшиц Григорий Моисеевич
Видео:Практическая значимость ПЦР-анализа в диагностике аспергиллезовСкачать
A Single-Tube Real-Time RT-PCR Assay for the RNA Detection and Quantification of Genetically Diverse HIV Including Rare Non-M Group of the HIV-1 and HIV-2
The RT-PCR method with real-time fluorescence detection was used for development of prototype of diagnostic kit for reliable diagnosis of genetic variants of RNA of the HIV-1of groups M, N, O, P and RNA of the HIV-2 in blood plasma and serum. The kit is stable against nucleotide defects, provides broad linear range of concentration of the HIV RNA, 100% analytical specificity and adequate analytical sensitivity: 42 МЕ/ml ( HIV-1 of group M), 45 copies/ml ( HIV-2 ), 92 copies/ml (HIV -1 of group O ), 90 copies/ml ( HIV-1 of group N). The kit provided successful detection and measurement of HIV RNA concentration in the samples of the international reference panel of the HIV-1 genotype. The results of the test correlate with results of commercial tests.
Видео:Диагностика COVID-19: роль серологических маркеровСкачать
Текст научной работы на тему «Однопробирочный тест для выявления и количественного анализа РНК генетических разновидностей ВИЧ, включая редкие не-М группы ВИЧ-1 и ВИЧ-2, на основе ОТ-ПЦР в реальном времени»
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Прасолова М.А.1’2’3, Иванов М.К.1’2 3, Гашникова Н.М.4, Нетёсова Е.С.2, Дымшиц Г.М.5
ОДНОПРОБИРОЧНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЭА РНК ГЕНЕТИЧЕСКИХ РАЭНОВИДНОСТЕЙ ВИЧ, ВКЛЮЧАЯ РЕДКИЕ НЕ-М ГРУППЫ ВИЧ-1 И ВИЧ-2, НА ОСНОВЕ ОТ-ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
1Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск; 2ЗАО «Вектор-Бест», 630559, п. Кольцово, Новосибирская область; ‘Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск; 4ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», 630559, п. Кольцово, Новосибирская область; 5Институт химической биологии и
фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск.
На основе метода ОТ-ПЦР с флюоресцентной детекцией в режиме реального времени разработан прототип диагностического набора, позволяющий надежно выявлять в сыворотке и плазме крови различные генетические варианты РНК ВИЧ-1 групп М,К,0,Р и РНК ВИЧ-2. Набор обладает высокой устойчивостью к нуклеотидным несоответствиям, широким линейным диапазоном измерения концентраций РНК ВИЧ, 100% аналитической специфичностью и хорошей аналитической чувствительностью: 42 МЕ/мл (ВИЧ-1 группы М), 45 копий/мл (ВИЧ-2), 92 копий/ мл (ВИЧ-1 группы 0), 90 копий/мл (ВИЧ-1 группы К). С помощью разработанного диагностического набора удалось успешно выявить и определить концентрацию РНК ВИЧ для всех образцов из международной референсной панели генотипов ВИЧ-1; результаты проведенных тестов коррелируют с данными, полученными с помощью коммерческих тестов. Ключевые слова: ВИЧ-1 группа O; ВИЧ-2; устойчивость к нуклеотидным несоответствиям; ОТ-ПЦР.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) продолжает оставаться одной из глобальных проблем здравоохранения: в мире количество людей, инфицированных ВИЧ-1, составляет 34 млн, в России — более 730 тыс. и продолжает расти [1]. Эффективность предотвращения дальнейшего распространения ВИЧ, как и лечения уже заразившихся, значительно зависит от точной, высокочувствительной и своевременной диагностики инфекции, в том числе выявления РНК ВИЧ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [2]. Тестирование препаратов донорской крови на РНК ВИЧ является обязательным во многих странах, в том числе и в России.
Особую проблему для диагностики ВИЧ-инфекции создает высокая генетическая изменчивость вируса. Выделены 4 генетические группы ВИЧ-1 (М, К, О и недавно описанная группа Р) [3]. Основной вклад в мировую эпидемию СПИДа вносят штаммы ВИЧ-1 группы М, которая в свою очередь делится на 9 субтипов и множество рекомбинантных форм [4]. Группы вирусов К, О и Р считаются редкими за пределами Африки, и в России пока официально не зарегистрировано ни одного случая заражения штаммами этих групп. Тем не менее уже описано много случаев инфицирования ВИЧ-1 группы О в разных странах Европы и США [5, 6]. Очевидно, что распространение редких групп N и Р также возможно. Ни один из отечественных и далеко не все импортные коммерческие тесты способны выявлять штаммы ВИЧ-1 не-М групп (причем эта проблема касается не только ПЦР, но и серологических методов [7]), что создает риск распространения таких недоступных для диагностики, но от этого не менее патогенных геновариантов вируса.
ВИЧ-2 также состоит из нескольких генетически удаленных друг от друга субтипов и их рекомбинан-
тов [8, 9]. Наиболее распространенными являются субтипы А и В. ВИЧ-2 встречается во всех частях света, хотя общее число инфицированных ВИЧ-2 гораздо ниже, чем ВИЧ-1. В силу генетической удаленности от ВИЧ-1 многие антиретровирусные препараты, в частности ненуклеозидные ингибиторы ревертазы, не эффективны при лечении пациентов с ВИЧ-2 [10]. Большинство современных серологических тестов выявляют антитела к вирусам обоих типов, однако к ПЦР-тестам такие требования до недавнего времени не предъявлялись, большинство коммерчески доступных диагностических наборов оптимизировано только для выявления РНК ВИЧ-1. Показано, что, как и в случае ВИЧ-1, вирусная нагрузка ВИЧ-2 в плазме крови коррелирует со стадией развития заболевания и ее измерение может использоваться в прогностических целях для мониторинга состояния пациента и назначения терапии [11]. Следовательно, определение РНК ВИЧ-2 актуально не только в качественном, но и в количественном варианте. Таким образом, существует объективная потребность в создании удобных для применения в клинических лабораториях доступных по цене высокочувствительных тестов для выявления и достоверной количественной оценки РНК ВИЧ-1 и ВИЧ-2, охватывающих все генетические группы и субтипы вируса.
Целью данной работы являлась разработка на основе метода ПЦР в реальном времени высокочувствительного теста для выявления РНК всех генетических групп ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в одной пробирке.
Материалы и методы
Биологический материал. Клинические образцы сыворотки или плазмы крови, содержащие РНК ВИЧ-1 группы М, а также образцы сыворотки крови здоровых доноров были предоставлены Новосибирским областным центром по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, лабораторией клинической иммунологии НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского г. Москвы.
Для определения предела чувствительности и границ динамического диапазона измерений концентраций использовали положительный контрольный образец (ПКО) РНК ВИЧ-1 субтипа А, охарактеризованный относительно международного стандарта РНК ВИЧ-1, полученной из Национального института биологических стандартов и контроля (NIBSC). Приготовление ПКО РНК ВИЧ-1 описано ранее [12].
Получение клинических образцов от пациентов, инфицированных ВИЧ-2 и ВИЧ-1 групп К,0,Р, было затруднительно из-за крайне малой распространенности этих вирусов в России. Основные этапы оптимизации теста проводили на искусственно синтезированных ДНК и РНК, соответствующих по нуклеотид-ным последовательностям имеющимся в базе данных фрагментам генома изолятов ВИЧ-1 групп О (8 геновариантов), групп N (2 геноварианта), группы Р, редких субтипов группы М (26 геновариантов) и ВИЧ-2 (субтипы А и В). Сборку двухцепочечных
матриц ДНК проводили путем полимеразного удлинения частично перекрывающихся олигонуклеотидов. В ДНК-матрицы, соответствующие референсным последовательностям субтипов и групп ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вводили дополнительно последовательность Т7-промотора для проведения транскрипции in vitro. Правильность сборки ДНК-матриц подтверждали секвенированием. Для очистки синтезированных ДНК-матриц применяли электрофорез в агарозном геле (агароза SeaKem® GTG™, «Lonza», Швейцария) с последующей пассивной элюцией. Концентрацию ДНК-матриц измеряли спектрофотометрически с использованием прибора Nanodrop2000. Разведения искусственных матриц ВИЧ-2 и ВИЧ-1 групп N и O, соответствующие концентрациям ДНК около 104 копий/мкл, аликвотировали, хранили при -40°С и использовали в качестве количественных стандартов для определения вирусной нагрузки и для исследования аналитических характеристик разработанного теста. Образцы искусственных РНК были получены путем транскрипции in vitro с помощью набора T7 transcription kit («Fermentas», Литва) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты реакции обрабатывали ДНКазой RQ1 («Promega», США). Полученную РНК осаждали этиловым спиртом, элюировали в воде, аликвотировали и хранили при -40°С.
Также в работе использовали лизат штамма ROD ВИЧ-2, полученный после культивирования вируса на чувствительных клетках. Путем секвенирования участка LTR размером 391 ну-клеотид и последующего филогенетического анализа подтвердили принадлежность данного образца к субтипу А. На основе лизата ВИЧ-2 был изготовлен ПКО РНК ВИЧ-2. Данный образец был разведен в пуле донорских сывороток, не содержащих маркеров ВИЧ, вирусных гепатитов В и С, разделен на аликвоты и лиофильно высушен. Концентрацию РНК ВИЧ-2 ПКО определяли посредством ПЦР-анализа с помощью разработанного теста, для построения калибровочной кривой использовали описанный выше количественный стандарт ВИЧ-2.
Проведение анализа. Выделение РНК проводили с использованием набора реагентов РеалБест Экстракция 1000 или Реал-Бест Экстракция 100 (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Для амплификации использовали готовую лиофильно высушенную реакционную смесь РеалБест МастерМикс ОТ (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), содержащую все компоненты для проведения ОТ и ПЦР в одной пробирке, кроме специфичных олигонуклеотидов. В смесь добавляли праймеры, соответствующие ВИЧ-1 и ВИЧ-2, в концентрации по 12,5-25 пмоль и флюоресцентно меченые зонды по 6-12,5 пмоль. В анализе использовали приборы iQ5
Нуклеотидные последовательности праймеров для амплификации участка ЬТК ВИЧ-1 групп Ш,0,Р и результаты их проверки на предмет устойчивости к мисматчам
🎦 Видео
Метод ПЦР в дифференциальной диагностике ОРВИСкачать
Диагностика ВИЧ ИФА, ПЦР, экспресс-тест на ВИЧСкачать
Выделение нуклеиновых кислот. Ручная методикаСкачать
Тесты на ВИЧ - Данила Коннов//быстрые тесты, ИФА, ПЦР, иммуноблот, период окна, лабораторные ошибкиСкачать
КАК МАКСИМАЛЬНО БЫСТРО ВЫЯВИТЬ ВИЧ? ВИДЫ АНАЛИЗОВ НА ВИЧ.Скачать
Цикл вебинаров: диагностика инфекций, передаваемых клещамиСкачать
28.09 КРУГЛЫЙ СТОЛ: "ВИЧ В РОССИИ: ФАРММЕДОБРАЩЕНИЕ И КАЧЕСТВО ЖИЗНИ"Скачать
ПЦР - диагностика вирусной инфекции, коронавируса - наглядное объяснение методаСкачать
Иммуноферментный анализ (ИФА)Скачать
Анализы на вирусные гепатиты - что подтверждает, что исключает гепатит - meduniver.comСкачать
Полимеразная цепная реакция. Сергей седыхСкачать
